سیتوژنتیک (آشنایی با انواع میکروسکوپ و طرز کار با آن)

سیتوژنتیک (آشنایی با انواع میکروسکوپ و طرز کار با آن)

در بررسی و مطالعه  سلول ، یکی از مشکلات  زیست شناسان ، کوچکی فوق العاده سلول و اجزاء آن می باشد.برای از بین بردن این مشکل ، از وسیله ای به نام میکروسکوپ (Microscope) یا ریزبین ، استفاده می شود.

میکروسکوپ از نظر لغوی از دو بخش میکرو به معنی کوچک و سکوپ به معنی رؤیت (مشاهده) تشکیل شده است.

میکروسکوپ نوری ، اولین میکروسکوپی است که توسط بشر ، ساخته شد.

 مراحل تکمیل میکروسکوپ نوری : 1) میکروسکوپ لی وان هوک  کک   42 بار بزرگ می کند. 2) میکروسکوپ رودلف ویرخف تا 500 برابر اشیاء را بزرگ می کند. 3) میکروسکوپ  مولر دارای  قدرت بزرگنمایی 1000 برابر است.

به میکروسکوپ نوری  میکروسکوپ مرکب نیز می گویند چون بزرگنمایی میکروسکوپ ، مجموع بزرگنمایی دو عدسی آن می باشد که یکی عدسی شیئی (objective)  و دیگری عدسی چشمی (ocular) است. و به این علت زمینه روشن (Bright Field)   نیز می گویند که نور از میان قسمتی شفاف عبور می کند و زمینه اطراف شئ مورد مطالعه را روشن می نماید. در این میکروسکوپ ، منبع نور دهنده ، نور مرئی است که معمولا از یک لامپ با تشعشع زیاد و یا یک آینه برای بازتاباندن نور به داخل میکروسکوپ ، استفاده می گردد.

هر میکروسکوپ از دو بخش مکانیکی و نوری تشکیل شده است.

1- بخش مکانیکی:در واقع قسمت هایی است که مستقیما در عبور و تشکیل تصویر نقش اصلی را به عهده ندارند و شامل کلیه بخش های نگاهدارنده، حرکت دهنده و ثابت کننده یک میکروسکوپ می باشند. مانند پایه ، دسته ، صفحه پلاتین ، شاریو ، صفحه گردان ، پیچ های تنظیم:(سریع و دقیق) ، گیره ها و لوله میکروسکوپ.

ـ پایه میکروسکوپ: به اشکال نعلی ، مدور، مکعب مستطیلی و مانند آن ساخته می شود.جنس پایه معمولا از فولاد سنگین انتخاب می گردد تا از هر گونه لغزشی جلوگیری شود.

ـ دسته میکروسکوپ: برای جابجایی میکروسکوپ به کار می رود و معمو لا داسی و هلالی شکل است.

ـ پیچ های تنظیم: بر روی دسته میکروسکوپ قرار دارند. شامل پیچ میزان سریع یا ماکرو متر و پیچ میزان دقیق یا میکرومتر می باشد.عمل آنها جابجا کردن لوله میکروسکوپ (در میکروسکوپ های قدیمی) در جهت بالا و پایین و بالعکس می باشد. در میکروسکوپ های جدید این پیچ ها معمو لا صفحه پلاتین را در جهت بالا به پایین و بالعکس جابجا می کنند.

ـ صفحه پلاتین: صفحه ای است فلزی یا کائوچویی که محل قرار دادن جسم مورد مطالعه می باشد.روی صفحه پلاتین سیستمی به نام شاریو(ارابه کش) پیش بینی شده است.شاریو دارای دو بخش تیغه ای برای نگهداری نمونه است و نیز پیچ هایی در زیر پلاتین قرار دارد که با چرخاندن آنها می توان نمونه را بر روی پلاتین، و یا مجموعه نمونه و پلاتین را به چپ و راست یا به جلو و عقب حرکت داد.

ـ سیستم ورنیه: در دو بعد عمود بر هم پلاتین، دو سیستم ورنیه ای پیش بینی شده است، که به کمک آنها می توان میزان جابجایی جسم در جهات مختلف و بازیابی منطقه ای خاص از جسم مورد مشاهده را انجام داد.

ـ صفحه گردان: قطعه فلزی است، تقریبا به شکل مخروط ناقص که در سطح پایین آن تعدادی سوراخ تعبیه شده است.به هر یک از این سوراخها، یک لوله عدسی شیئی پیچ می شود. صفحه گردان در بالا به لوله میکروسکوپ متصل می گردد.

ـ لوله میکروسکوپ: در قسمت بالای آن اکولر (لوله عدسی چشمی) و دربخش پایین آن صفحه گردان قرار دارد. در بیشتر موارد طول لوله میکروسکوپ 16 سانتیمتر یا 160 میلیمتر است.

2- بخش نوری: شامل سه بخش اساسی است:دستگاه روشنایی ـ ابژکتیف ـ اکولر

ـ دستگاه روشنایی: از دو بخش تشکیل شده است:

الف) منبع نور: به طور معمول لامپ کوچک 6 تا 10 ولت است که اغلب در زیر پایه میکروسکوپ قرار دارد.

ب) کوندانسور: کوندانسور از مجموعه ای از عدسی های محدب (کوژ) یا محدب الطرفین ساخته شده که عمل آنها همگرا کردن پرتو های نوری حاصل از منبع نور و تابانیدن آنها بر روی جسم است.

انواع کوندانسور

1. کوندانسور آبه: از مجموعه دو عدسی محدب (محدب الطرفین) ساخته شده است و  انحرافات کروی و رنگی (نوری) را تصحیح نمی کند.این کوندانسور در فاصله بین منبع روشنایی تا جسم و به طور معمول در زیر صفحه پلاتین قرار دارد.

2. کوندانسور آپلانتیک: این نوع کوندانسور دارای یک عدسی محدب بینابینی اضافی می باشد. کار این عدسی اضافی اصلاح انحرافات کروی است.با این کوندانسورها ، انحرافات رنگی اصلاح نمی شود و برای اصلاح آن بایستی از نور تک رنگ استفاده کرد.

انحرافات کروی: این گونه انحرافات ناشی از تحدب و کرویت عدسی ها می باشد. اگر یک دسته پرتوهای نوری موازی به یک سطح کروی(مثلا یک عدسی محدب) برخورد کند ، همه به یک میزان پراش نمی یابد. پرتو هایی که از مرکز می گذرند، بدون شکست پیش می روند. حال آنکه پرتوهایی که به محیط و کناره عدسی برخورد کنند پراش بیشتری دارند به این ترتیب هر چه شعاعهای نورانی به مرکز سطح کروی نزدیکتر باشند، شکست کمتری دارند. و هر چه قدر از مرکز آن دور شوند، شکست بیشتری می یابند.پراش نابرابر همه پرتو های نورانی موازی را که به یک سطح کروی می رسند، انحرافات کروی نامند. کوندانسور های آپلانتیک با عدسی های محدب اضافی که دارند موجب همگرایی بیشتر پرتو ها(کوچک شدن منطقه کانون) و در نتیجه یکنواختی بیشتر شدت روشنایی روی جسم می شوند.

انحرافات رنگی: تفکیک طیف های سازنده هر نور مرکب در برخورد با یک عدسی و شکست متفاوت آنها را اصطلاحا انحرافات رنگی نامند.این انحرافات از وضوح تصویر می کاهد. برای اصلاح آن از نور تک رنگ که فقط دارای یک طول موج خاص می باشد، استفاده می شود. نور تک رنگ را می توان با استفاده از فیلترهای رنگی به دست آورد.

فیلتر ها(صافی های نور):فیلتر ها صفحات شیشه ای رنگین، تیره رنگ یا مشبکی هستند که از آنها برای ایجاد روشنایی یکنواخت ، پراکندگی نور و بالا بردن تضاد استفاده می شود. از آنجا که هر فیلتری طیف همرنگ خود را عبور می دهد و بر عکس از عبور طیف های مکمل رنگ خود جلوگیری می کند، با استفاده از فیلترهای رنگی می توان تک رنگ دلخواه و مناسب برای هر مشاهده  میکروسکوپی را فراهم ساخت.هنگام مشاهده میکروسکوپی با میکروسکوپ های فاز متضاد و زمینه تاریک که نمونه های مورد بررسی رنگ نشده اند، به کارگیری یک فیلتر سبز رنگ موجب سهولت مشاهده می شود.با استفاده از فیلترهای پلاریزان در زیر لام و بر روی عدسی چشمی می توان نور را پلاریزه به دست آورد که در مطالعه دانه های نشاسته و مواد بلوری در سلولهای جانوری و گیاهی، کوتیکولهای گیاهی ، مو و پشم و سایر فیبر های طبیعی ، دندان و استخوان بدون کلسیم شده و فیبرهای عضلانی کاربرد بسیار دارد.

دیافراگم: وسیله تنظیم شدت نور میکروسکوپ است و جزء بخش مکانیکی است.هر میکروسکوپ به طور معمول دارای دیافراگم زمینه، دیافراگم کوندانسور و دیافراگم اکولر است. دیافراگم زمینه میزان نوری را که منبع روشنایی به کوندانسور می رسد تنظیم می کند و معمولا در بالای منبع روشنایی قرار دارد. دیافراگم کوندانسور، شدت نوری را که از کوندانسور گذشته و به جسم می رسد تنظیم می کند و اغلب در زیر کوندانسور قرار دارد.دیافراگم اکولر بر حسب نوع اکولرها، در داخل لوله اکولری( اکولر های منفی) و یا قبل از عدسی شیئی اکولر قرار دارد(اکولر مثبت).

دیافراگم زمینه و دیافراگم کوندانسور دارای اقسام مختلفی به شرح زیرند:

الف) دیافراگم ساده:صفحه ای فلزی یاکائوچویی دارای چند سوراخ با قطر های متفاوت است.

ب) دیافراگم آیریس:این دیافراگم همانند مردمک چشم امکان تنگ وگشاد شدن را دارد.

ج) دیافراگم حلقوی: این دیافراگم دارای حلقه هایی با قطر متفاوت برای عبور نور است. ساختمان آن به نحوی است که از عبور پرتو های نوری مرکزی جلوگیری می کند و پرتو های محیطی را که پراش بیشتری پیدا می کنند به جسم می تاباند. از این نوع دیافراگم، در میکروسکوپ فاز متضاد استفاده می شود.

د) دیافراگم زمینه تاریک(هلالی):این نوع دیافراگم از عبور پرتوهای نوری مرکزی جلوگیری می کند ، و فقط پرتوهای نوری کناری از دو منطقه تقریبا هلالی شکل عبور کرده و به کوندانسور می رسد. از این نوع دیافراگم، در میکروسکوپ فاز متضاد استفاده می شود.

ابژکتیف:هر ابژکتیف اساسا از تعدادی عدسی تشکیل شده است.عمل کلی ابژکتیف تشکیل اولین تصویر از جسم است.این تصویر بزرگتر از جسم، معکوس و حقیقی است بنابراین جسم باید بین f و 2f قرار گیرد.ابژکتیف مهمترین بخش نوری هر میکروسکوپ است. طول عدسی های شیئی با یکدیگر متفاوت است. عدسی کوچکتر ، عدسی با بزرگنمایی ضعیف تری است در حالی که عدسی بزرگتر ، عدسی ای با بزرگنمایی قوی تر می باشد.عدسی های ابژکتیف از خاک هایی با جنس متفاوت که برخی درشتی و ویژگی های مختلف دارند، ساخته می شود.

ابژکتیف ها را به حسب روش به کارگیری ، ترکیب عدسی و کارآرایی آنها به شرح زیر تقسیم بندی می کنند:

1- بر حسب روش به کارگیری: ابژکتیف ها را به دو نوع خشک و ایمرسیون نام گذاری می کنند:وقتی محیط شفاف بین جسم و ابژکتیف (فاصله فروتنال) هوا یا گاز باشد، ابژکتیف را اصطلاحا ابژکتیف خشک نامند و اگر این فاصله به وسیله مایعی (آب ، گلیسیرین ، روغن سدر ،آلفا برمونفتل و مانند آن) پر شود، ابژکتیف را ایمرسیون می گویند.در درشتنمایی های بالا که به نور بیشتری نیاز است، از شرایط ایمرسیون استفاده می شود که ضمن آن مایع موجود در فاصله فرونتال کار یک عدسی محدب را انجام می دهد و پرتو های نوری را کانونی و همگرا می کند و به ابژکتیف می رساند و به این ترتیب از هدر رفتن آنها پیش گیری می کند.

2-  بر حسب ترکیب و کارایی عدسی ها:

الف ـابژکتیف  آکروماتیک: انواع مختلف شیشه از لحاظ  درجه شکست رنگهای مختلف با یکدیگر تفاوت دارند.در ابژکتیف های آکروماتیک عدسی هایی را که از ترکیب شیشه های مختلف ایجاد شده اند به صورت مجموعه های دوتایی (مقعر،محدب) به کار می گیرند. در ابژکتیف های آکروماتیک با استفاده از ترکیب عدسی های دارای جنس وتحدب متفاوت (عدسی های مقعرو محدب)، پرتوهای قرمز و آبی را در یک کانون جمع آوری کرده و از مجموعه آنها ، طیف سبز مایل به زرد را می سازند ،که در چشم بیشترین حساسیت را ایجاد می کند. این نوع عدسی ها را عدسی های دارای سیستم دو تایی می نامند.

ب ـ ابژکتیف آپوکروماتیک: در این ابژکتیف ها ترکیب عدسی های مختلف به نحوی است که مجموعه ای از طیف های آبی ـ سبز و قرمز هم کانون می شوند و به این ترتیب مقدار زیادی از انحرافات رنگی اصلاح می گردد. عدسی های به کار گرفته شده در ابژکتیف های آپوکروماتیک معمولا ساختمان سه تایی دارند. این ابژکتیف ها به ویژه برای عکس برداریهای میکروسکوپی مناسبند و در میکروسکوپ های دقیقتر کاربرد دارند.

یاد آوری می شود نوع دیگری از ابژکتیف ها به نام ابژکتیف فاز مخصوص میکروسکوپ های فاز متضاد وجود دارد که ویژگی های آن در بخش میکروسکوپ فاز متضاد مورد بحث قرار می گیرد.

 فاصله کانونی ابژکتیف با درشت نمایی آن نسبت عکس دارد و هر چه درشت نمایی بیشتر شود، فاصله کانونی کمتر می شود.

اکولر: اکولر ها در مجموع کار یک ذره بین را انجام می دهند.اکولر از تصویر ایجاد شده به وسیله ابژکتیف، تصویری مجازی، مستقیم(معکوس نسبت به جسم اولیه) و بزرگتر درست می کند و باید تصویر اول در فاصله کانونی عدسی اکولر تشکیل یابد.

تشکیل تصویر در میکروسکوپ:تشکیل تصویر در میکروسکوپ از قوانین تشکیل تصویر در عدسی های محدب پیروی می کند.ابژکتیف از جسم تصویر اول را می سازد که تصویر حقیقی ، بزرگتر و معکوس است.اکولر همانند ذره بین، از این تصویر، تصویر نهایی را که مجازی، بزرگتر و مستقیم است را می سازد.

توان تفکیک یا قدرت تمیز میکروسکوپ:کوچکترین فاصله قابل تشخیص بین دو نقطه واقع بر یک سطح را که به وسیله ی یک سیستم نوری، قابل رؤیت باشد، توان تفکیک آن دستگاه گویند.هر چه مقدار عددی توان تفکیک کمتر(کوچک تر) باشد، توان تفکیک دستگاه نوری بیشتر(بهتر) است.

انواع میکروسکوپ نوری:

1- میکروسکوپ تشریح برجسته بین  (Stereoscope dissection microscope):

میکروسکوپ تشریح برجسته بین (استرئو سکوپ) دو امتیاز مشخص نسبت به میکروسکوپ معمولی دارد: 1- به شما امکان میدهد که اشیاء زیاد بزرگ یا زیاد ضخیم( که برای چشم غیر مسلح ، بسیار کوچک می باشند) را با بزرگنمایی زیاد مشاهده کنید.2- امکان مشاهده سه بعدی اشیاء را برای شما فراهم می کند.

2- میکروسکوپ فاز متضاد(Phase contrast microscope): علت اینکه سلولهای زنده امکان جذب نور کمی دارند و شفافند، وجود مقدار زیادی آب در آنها  است.معهذا پس از خشک شدن نیز تغییرات کمی در شفافیت آنها ایجاد می شود، یا تا حدی دارای تضاد نوری می گردند زیرا اکثر عناصر سازنده آنها وزن اتمی کمی دارند. مشکل کم بودن تضاد نوری سلول را می توان با استفاده از رنگهایی که به طور انتخابی بر روی مواد متشکله مختلف سلول ثابت می شوند از میان برداشت. تنوع و تغییرات رنگ موجب تضاد نوری می شود. اما در بیشتر موارد روشهای رنگ آمیزی را نمی توان برای سلولهای زنده اعمال کرد. شدت موج ضمن عبور از جسم تغییر نمی یابد ولی سرعت آن تغییر می کند. اگر ضریب شکست جسم خیلی بیشتر ازمحیط باشد ، از آن تاخیری حاصل می شود که آن را تغییر فاز نیز می نامند. موج پس ازخروج از جسم سرعت اولیه خود را مجددا پیدا می کند، اما تاخیر ایجاد شده همچنان حفظ می گردد.میکروسکوپ فاز متضاد که به وسیله زرنیک درسال 1934 ابداع شد، امکان می دهد که اختلاف فازهای کوچک را تشدید کرده( و بنابراین شدت آنها را زیاد کنیم) و در نتیجه تشخیص آنها به وسیله چشم یا صفحه عکاسی را امکان پذیر سازیم. میکروسکوپ های فاز کنتراست ، کوندانسور های مخصوصی دارند و اشیائی در این میکروسکوپها قابل مشاهده هستند که توانایی تغییر دادن نوری که از درون و اطرافشان ( لبه هایشان ) عبور می کند را دارند. نور نه تنها به وسیله دیواره سلولی می تواند انکسار پیدا کند بلکه به وسیله هر یک از ساختمانهای بزرگی که در سیتوپلاسم وجود دارد( که چگالی آنها بیشتر از مواد موجود در اطراف سیتوپلاسم یا محیط کشتشان می باشد) نیز می تواند منکسر شود. هر شیئی که به وسیله این تکنیک مشاهده می شود ، با یک حلقه نور ، احاطه شده است که در این صورت یک ساختمان حقیقی را در آن نمی توان مشاهده نمود.در میکروسکوپ فازمتضاد، جانبی ترین نوری که از ابژکتیف می گذرد به اندازه   4/λ از نوری که از مرکز ابژکتیف عبور می کند تاخیر یا تقدم فاز دارد. به منظور ایجاد این اختلاف فاز ، در سطح کانونی پشتی ابژکتیف ، یک صفحه حلقوی فاز و بعد در محل کوندانسور ، یک دیافراگم حلقوی قرار داده می شود. صفحه فاز ، صفحه ای شفاف است که دارا ی یک بر آمدگی یا یک گودی است ، ابعاد و شکل آن با تصویر مستقیم کوندانسوری که در زیر پلاتین قرار گرفته است مطابقت دارد.تضاد از تداخل بین تصویر هندسی مستقیمی که به وسیله بخش مرکزی ابژکتیف ساخته شده و تصویر جانبی تفرق یافته ای که به اندازه 4/λ تاخیر یا تقدم داشته است ، صورت می گیرد. در حالت تضاد منفی( یا تضاد درخشنده) ، انرژی دو دسته اشعه جمع می شود و جسم خیلی روشنتر از زمینه به نظر می رسد. در حالت تضاد مثبت (یا تضاد تیره) ، انرژی دو دسته از هم کم می شود و در نتیجه تیره تر از زمینه دیده می شود. با این روش ، جسم شفاف به حسب ضخامتش و با اختلافی که ازنظر ضریب شکستش با محیط دارد، به رنگ خاکستری دیده می شود.

3- میکروسکوپ تداخلی(Nomarski interference): میکروسکوپ تداخلی، از نظر طرز عمل اصول مشابهی با میکروسکوپ فاز متضاد دارد، البته این میکروسکوپ تفاوتهایی با میکروسکوپ فاز متضاد دارد که به شرح زیر می باشد: اولا میکروسکوپ تداخلی به نمونه هایی که ضخیم تر از باکتری ها هستند، نیاز دارد(سلولهای رویشی و اسپور قارچها) ثانیا در نتیجه وجود دو قطبی کننده (polarizer) و منشور مخصوص در کوندانسور ، تصویر ، شکل گیری واضح تر و روشنتری نسبت به میکروسکوپ فاز متضاد دارد. ثالثا شئ در این میکروسکوپ هاله ای ندارد و به صورت سه بعدی ظاهر می شود. قدرت تفکیک در میکروسکوپ تداخلی  حدود دو برابر میکروسکوپ معمولی (زمینه روشن ) می باشد یعنی حدود 0.1 میکرومتر.و نیزبا این برتری که به کمک آن اطلاعات کمی(مقداری) را نیز می توان به دست آورد. به کمک این دستگاه می توان اختلاف فاز نوری ساختمان های مختلف سلولی را مشخص کرد، و در نتیجه وزن خشک نسبی آنها را سنجید. میکروسکوپ   تداخلی  امکان  می دهد  که  تغییرات  جزئی  و  ممتد(پیوسته)   ضریب  شکست  را  مشخص  سازیم  در حالی  که میکروسکوپ  فاز متضاد تنها ضریب شکست های نا پیوسته را آشکار می سازد.تغییرات فاز به وسیله تغییرات رنگ و تا آن حد مشخص می شوند که سلول زنده ممکن است شبیه سلولی تثبیت و رنگ آمیزی شده به نظر برسد. نوری که به وسیله یک  منبع واحد ایجاد شده به دو بخش تقسیم می گردد.یک دسته از شعاع های نورانی از جسم می گذرند و دسته دیگر بدون عبور از جسم وارد دستگاه می شوند. سپس این دو دسته اشعه همدیگر را تلاقی کرده و همانند آنچه در یک میکروسکوپ فاز متضاد صورت می گیرد تداخل پیدا می کنند.اشعه ای که از جسم عبور کرده و متحمل تغییر فازی شده،نسبت به اشعه مستقیم ،دارای تاخیر می شود.مانند آنچه در یک میکروسکوپ پلاریزان صورت می گیرد،این تاخیر(r)به ضخامت جسم (t)واختلافی که بین ضریب شکست جسم(n_o) و ضریب شکست محیط(n_m)وجود دارد وابسته است،به طوری که:                                                    n_o – n_m = r/t

و به این ترتیب وقتی مقدار n_m مشخص باشد،می توان مقدار n_o (ضریب شکست جسم) را به دست آورد.با میکروسکوپ تداخلی می توان ضخامت جسم(t)،تراکمش از ماده خشک و آب آن را همزمان با هم و با اندازه گیری های پیوسته (پشت سر هم) اختلاف فاز نوری در دو محیط که ضریب شکست آنها مشخص است ،اندازه گیری کرد.

4- میکروسکوپ زمینه تاریک(Dark field microscope):اساس ساختمان این میکروسکوپ همانند یک میکروسکوپ نوری معمولی است با این تفاوت که دیافراگم کوندانسور آن به نحوی ساخته شده که بخش میانی آن غیر شفاف و مانع عبور پرتو های نوری مرکزی است و نور تنها از کناره های دیافراگم و به طور مایل به جسم می تابد. با استفاده از این دیافراگم:الف- زمینه رؤیت میکروسکوپ تاریک می شود. ب- از پرتو های محیطی که به طور مایل به جسم می تابد، تنها بخش پراش یافته به وسیله سطح جسم وارد ابژکتیف می شود و تصویررا به وجود می آورد. هیچ پرتوی که مستقیما از جسم بگذرد، وارد ابژکتیف نخواهد شد. با میکروسکوپ زمینه تاریک می توان برخی از ساختمان هایی را که ابعادشان پایین تر از حد دید میکروسکوپ نوری معمولی است رؤیت یا عکس برداری کرد، (اولترامیکروسکوپی). این میکروسکوپ معمولا برای مشاهده میکرو ارگانیسم هایی استفاده می شود که اولا قابل نگهداری و مشاهده به طور زنده هستند، ثانیا خیلی کوچک و باریک می باشند و مطالعه در مرفولوژی (ریخت شناسی) آنها بدون رنگ آمیزی بهتر است، همچنین کاربرد آن بیشتر برای مطالعات ریخت شناسی و برخی حرکات سلولی یا اندامک های سلولی است. چون پرتوها در رسیدن به سطح جسم پراش می یابند،بنابراین جزئیات ساختمان درونی سلول یا اندامک های آن مشخص نخواهد شد .در سلولهای کشت شده که با میکروسکوپ زمینه تاریک بررسی می شوند،هستک،پوشش هسته،میتوکندری ها و ذرات لیپیدی،درخشان به نظرمی رسند،در حالی که زمینه سیتوپلاسم تیره می ماند.

5- میکروسکوپ پلاریزان(polarizing microscope):برای بررسی ساختمانهای زیستی آنیزوتروپ(وقتی تراکم اتم ها و مولکولهای تشکیل دهنده جسمی در جهات مختلف آن ناهمگن باشد، جسم را آنیزوتروپ نامند) که خاصیت انکسارمضاعف نور را دارند، مثل سلولهای عضلانی فیبر های کلاژن، فیبر ها در گیاهان استفاده می شود. میکروسکوپ پلاریزان دارای دو قطعه مخصوص است که آنها را قطبی کننده و تجزیه کننده نامند.قطبی کننده،در زیر کوندانسور قرار گرفته و نور قطبی شده را به خط مستقیم به جسم می فرستد.تجزیه کننده،در لوله میکروسکوپ و در بالای عدسی ابژکتیف قرار دارد.با جابجا کردن تجزیه کننده می توان سطح یا جهت قطبیت آن را به جهت قطبیت پلاریزور تغییر داد. وقتی تجزیه کننده به اندازه360 درجه چرخانده شود،میدان دید میکروسکوپ در هر چرخش180 درجه ای به تناوب،روشن و تیره می گرد.اگر سطح قطبیت آنالیزور و پلاریزور موازی باشد ، حداکثر مقدار نور وارد ابژکتیف می شود و میدان دید روشن می گردد برعکس وقتی سطح قطبیت آنالیزور عمود بر سطح قطبیت پلاریزور ، قرار گیرد هیچ نوری وارد ابژکتیف نمی شود و میدان دید تاریک است. حالت متداول کار با یک میکروسکوپ پلاریزان بر این بنا ست که نمونه را به اندازه ای بچرخانیم که ، در میدان دید میکروسکوپ ، نقاط روشنایی ماکسیمم و مینیمم به دست آیند. وقتی محور قطبیت جسم مورد بررسی ، زاویه 45± درجه با محورهای پلاریزور و آنالیزور بسازد، روشنایی ماکسیمم حاصل می شود.میکروسکوپی با نور پلاریزه، به طور غیر مستقیم به منظور برخی تحلیل های فراساختمانی سلول به کار می رود.

6- میکروسکوپ با پرتو های فرابنفش(Ultraviolet microscope):میکروسکوپ هایی را هم که با پرتو های فرابنفش(با طول موج های نزدیک به پرتو های نوری) به کار گرفته می شوند، جزء میکروسکوپ های نوری به حساب می آورند.استفاده از پرتو های فرابنفش که طول موج کوتاهتری از پرتو های مرئی دارند، توان تفکیک میکروسکوپ را بهبود می بخشد. این میکروسکوپ ها کاربرد وسیعی در بررسی های سلول شناسی و به ویژه بررسی های به حالت فلوئورسانس و ابمونوفلوئورسانس پیدا کرده اند. پرتوهای فرابنفش به طور کلی مخرب و کشنده سلولهای زنده ، اندامک ها و اجزاء سلولی هستند به همین جهت بیشتر از آنها در ایجاد فلوئورسانس و در روشهای ایمونو سیتوشیمی استفاده می شود.وقتی برخی اتم ها به وسیله محرکی از جمله پرتو های دارای طول موج کوتاه مثل پرتو بنفش تحریک شود ممکن است الکترون ها تحریک و پر انرژی شده از مدار خود خارج شوند.برای آنکه الکترون های تحریک شده بتوانند به مدار خود بازگردند بایستی مقداری از انرژی را که گرفته اند، از دست بدهند، چنانجه انرژی از دست داده شده به حد طول موج های مرئی برسد،پدیده فلوئورسانس صورت گرفته و جسم (اتم یا مجموعه اتم ها)فلوئورسان شده است.این فلوئورسانس را فلوئورسانس اولیه نامند.برای مثال برخی ترکیبات از مشتقات لیپیدی، موم ها و یا کراتین ها فلوئورسانس اولیه دارند.اما اغلب ترکیبات سلولی فلوئورسانس اولیه ندارند، در این حالت برای درخشان کردن آنها از ترکیبات رنگی مختلفی به اسم فلو ئوروکروم ها استفاده می شود. به حسب نوع جسم ،نوع فلوئوروکروم و طول موج پرتوهایی که به جسم تابانیده می شود، نوع و شدت فلوئورسانس متفاوت است و به همین دلیل می توان ترکیب های سلولی را با رنگهای فلوئورسانس کننده اختصاصی و نوع فلوئورسانسشان جایابی و شناسایی کرد.هم اکنون به منظور تشخیص اجزای اسکلت سلولی، گیرنده های سطح سلول ها، تشخیص پادگن ها و پادتن ها و حتی تشخیص های دقیق در آسیب شناسی از میکروسکوپ های فرابنفش و ایجاد حالت فلوئورسانس به کمک آنها، استفاده گسترده ای می شود. عدسی ها از نوع کوارتز هستند. به منظور جلوگیری از تابش پرتوهای فرابنفش به چشم بیننده ، در مسیر پرتوها پس از تابش آنها به جسم و ایجاد حالت فلوئورسانس ، فیلترهایی قرار می دهند که از عبور پرتوهای فرابنفش جلوگیری می کند.