آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه ۳): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

نوشته شده توسط اگريسافت    2,452 بازدید     بدون دیدگاه   

آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه 3): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

جلسه سوم: واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

نکاتی که باید قبل از انجام عمل PCR بدانیم:

• از خصوصیات آنزیم تک پلیمراز این است که انتهای 3’ هر رشته یک آدنین قرار می‌دهد.
• کنترل مثبت و منفی برای رپید نداریم. می‌خواهیم ببینیم مشکلی در PCR وجود نداشته باشد

– کنترل منفی: همه موارد مورد نیاز به غیر از رشته الگو اضافه می‌کنیم.

– کنترل مثبت: از ژن اصلی که رشته الگو وجود داشته باشد.

• روش رپید حتی گونه ها را هم می‌تواند از هم جدا کند ولی زیرگونه ها را نمی‌تواند جدا کند و در این گونه موارد می‌توان از ISSR و RFLP و… استفاده کرد.
• وقتی یک توالی را برای ساخت پرایمر سفارش می‌دهیم قبل از آن می‌پرسند با چه O.D ساخته شود.
• پرایمر را بصورت خشک (Frizedryer) درخواست کنیم نه مایع. به همراه آن یک فرم اطلاعات می‌دهند که مثلاً چه مقدار آب به آن اضافه کنیم. ابتدا تمام 10 میکرومولار را نریزیم بلکه ابتدا استوک درست کنیم (با مقدار آب کمتر) و در جای مطمئن نگهداری کنیم.
• اگر PCR به ندرت جواب نداد یکی از اجزای آن که احتمالاً خراب است پرایمر می‌باشد.
• هنگام اضافه کردن مواد بهتر است موادی که غلظت لازم آنها کمتر است در مراحل آخر اضافه کنیم.
• در گرفتن آب دوبار تقطیر با سمپلر همیشه یکی دو تا میکرولیتر بیشتر بگیریم تا برای آخرین رشته الگو، آب کم نیاوریم.

(مقادیر بالا بر حسب میکرولیتر μl می باشد)

• MgCl₂برای ایجاد شرایط بهینه برای واکنش PCR اضافه می شود.
• آنزیم سنگین است و هنگام ریختن با سمپلر دقیقاً معلوم است که ریخته می‌شود.
• رشته الگو همان قطعه مورد نظر (رشته الگو ـ template) است و به علت غلظت کم و سبکی آن هنگام ریختن با سمپلر معلوم نیست که ریخته می‌شود یا نه.
• در انتها با سمپلر چند بار کل موارد بافر را بالا کشیده و دوباره می‌ریزیم تا خوب مخلوط شود. سپس به مقدار برابر (25تایی) در سه ویال تقسیم می‌کنیم و در دستگاه PCR می‌گذاریم.
• PCR در سه مرحله انجام می‌شود: