اردیبهشت
۱۰
۱۳۹۳

آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه ۴): انتقال ژن توسط آگروباکتریوم

آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه 4): انتقال ژن توسط آگروباکتریوم

جلسه 4: انتقال ژن توسط آگروباکتریوم

دریافت فایل word DN1

  • شرایط رشد باکتری آگروباکتریوم:

– تاریکی

– دمای 28 درجه

  • بطور کلی آگروباکتریوم به ترشح مواد فنلی ناشی از زخم گیاهان دولپه، حساس است (اثر مثبت بر فعالیت این باکتری). مشکل انتقال ژن توسط آگروباکتریوم به گیاهان تک لپه عبارت است از:

1- عدم ترشح مواد فنلی به منظور تحریک فعالیت آگروباکتریوم و ترشح مواد دیگری که مانع فعالیت آن می شود. که برای حل این مشکل می توان از موادی که دارای خواص مشابه مواد فنلی هستند مانند Acetosyringone استفاده کرد. مخصوصا در کار با کالوس دارای اهمیت است، چون گیاه نیست که آن را به منظور ترشح مواد فنلی زخمی کنیم و همچنین در مورد جنین، چون ایجاد زخم در آن اثر منفی در باززایی دارد.

2- نیاز به انتخاب نقاط مریستمی خاص.

ممکن است آگروباکتریوم پلاسمید دیگری (بزرگ) داشته باشد که برای این کار مناسب نیست.

T-DNA در دو انتهای خود قسمتهای برشی دارد که حفاظت شده است و همچنین قطعه را بطور تصادفی به ژنوم گیاه منتقل می کند.

  • محیط کشت‌های مورد نیاز:

1. محیط کشت LB : به منظور رشد باکتری

باکتری را که در محیط LB کشت دادیم، سانتریفیوژ می کنیم (3000 دور ـ10 دقیقه) ! رسوب باکتری ! افزودن محیط القاء یا آب استریل به مقدار دوبرابر (24 ؟؟) ! عمل ورتکس ! ؟؟؟ باکتری ! انتقال به پتریدیش

آب استریل مورد استفاده بهتر است که سرد باشد ! مستعد کردن باکتریها

آماده کردن اکسپلنت‌های برگ توتون:

بذر توتون را در محیط کشت قبلا کشت دادیم. علت استفاده از محیط کشت: تولید برگهای ظریفتر و عاری از آلودگی.

طبق پروتکل از برگهای 7 روزه استفاده می کنیم (بسته به نوع گیاه متفاوت است) برای توتون برگها تقریبا 4 سانتیمتر باشد. رگبرگ اصلی حتما جز اکسپلنت بیاوریم و حذف نکنیم (تغذیه از آن ! باززایی بیشتر و بهتر). ابتدا به رگبرگ اصلی یک خراش طولی می دهیم و آن را به چند قسمت برش می دهیم. نوک ابتدا و انتهای برگ و کناره‌های آن را جدا کرده و دور می ریزیم.

اکسپلنت آماده شده را در پتریدیش حاوی محلول باکتری می گذاریم ! بعد از 2 دقیقه آن را برمی گردانیم ! بعد از 2 دقیقه دیگر روی کاغذ صافی می گذاریم تا خشک شود. (اگر بیشتر در محلول بماند پلاسیده می شود)

2. محیط کشت تلقیح

محیط MS بدون هورمون و حاوی گلوکز (به جای ساکارز) و فاقد آنتی بیوتیک

اکسپلنت ها را بعد از خشک شدن از روی کاغذ صافی به این محیط منتقل می کنیم به طوری که پشت برگها رو به بالا باشد.

به منظور افزایش قابلیت آگروباکتریوم برای تلقیح استفاده می شود، یعنی به آن فرصت می دهیم تا رشد کند.

3. محیط Co cultivation

محیط MS دارای هورمون به منظور باززایی گیاه

نگهداری به مدت 2 روز در تاریکی و دمای 28 درجه

4. محیط سلکسیون

محیط MS دارای هورمونهای باززایی + آنتی بیوتیک

در اینجا از دو آنتی بیوتیک به منظور حذف گیاهان غیر تراریخته و آگروباکتریوم استفاده می شود:

– هیگرومایسین: بعد از 2 روز اضافه می شود. ژن مقاومت به آن در کنار ژن هدف است نه در سطح پلاسمید و برای حذف گیاهان غیر تراریخته استفاده می شود.

– سفاتوکسین: به منظور جلوگیری از رشد زیاد از حد آگروباکتریوم و حذف آن استفاده می شود.

نگهداری به مدت 1 ماه (16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی) و دمای 28 درجه

مقدار هیگرومایسین در این محیط کشت برای گیاهان مختلف متفاوت است. (برای توتون: mg/L 15)

 

  • نکات:

– برگ توتون چون پرزدار است، به راحتی آب جذب می کند و نیاز به برگرداندن آن نیست ولی بهتر است این کار را انجام دهیم.

–  برگ کاهو مقاومتر است و نیاز به زمان بیشتر (10 دقیقه) دارد.

– تیمار با دو آنتی بیوتیک کانامایسین و استرپتومایسین قبل از کشت باکتری در محیط LB (در انتهای مراحل انتقال ژن هدف به پلاسمید آگروباکتریوم و کلونینگ و به منظور انتخاب باکتری‌های دارای پلاسمیدهای نوترکیب) انجام می شود.

– کانامایسین: برای ارزیابی مقاومت پلاسمید

استرپتومایسین: برای ارزیابی مقاومت باکتری (ژن مقاومت به آن بر روی ژنوم باکتری قرار دارد)

 

فرستادن دیدگاه

مشاوره و راهنمايي

اطلاعيه

1. در صورت خريد چندين جزوه بصورت يكجا، مي توانيد به سايت فروشگاهي اگريسافت مراجعه فرماييد:
agrifile.ir

2. سفارش پرينت، طلق و فنر جزوات و ارسال با نازل‌ترين قيمت پذيرفته مي شود.
نحوه سفارش/

فرهنگ واژگان تخصصي

تازه هاي اگريسافت

> فروشگاه كتاب

> ترجمه تخصصی مقالات فارسی به انگلیسی

> مشاوره در زمينه مقالات ISI :
ـ استخراج مقاله از پایان نامه های کارشناسی ارشد و دکتری و طرح های پژوهشی؛
ـ ویرایش علمی مقالات متقاضیان قبل از ارسال به مجلات؛
ـ انتخاب مجلات ISI متناسب با کیفیت مقالات و همچنین زمان متقاضیان؛
ـ تشخیص اعتبار مجلات ISI ؛
ـ اطلاع رسانی در مورد مجلات خارج شده از لیست ISI ؛
ـ ارسال مقالات و پیگیری اخذ اصلاحات داوران؛
ـ انجام اصلاحات داوران و ادیتور مجلات تا زمان اخذ پذیرش نهایی و همچنين آناليز ديتا ؛
ـ اطلاع رسانی به موقع در مورد لیست سیاه وزارت علوم و دانشگاه ها.

فعالسازی فرهنگ واژگان Breedic

برای فعال سازی نرم افزار اینجا کلیک نمایید.

فعالسازي فرهنگ واژگان Biodic

1. نسخه اینترنتی

2. نسخه CD