اردیبهشت
۱۰
۱۳۹۳

آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه ۳): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

آزمایشگاه درس مهندسی ژنتیک (جلسه 3): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

جلسه سوم: واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

نکاتی که باید قبل از انجام عمل PCR بدانیم:

  • از خصوصیات آنزیم تک پلیمراز این است که انتهای 3’ هر رشته یک آدنین قرار می‌دهد.
  • کنترل مثبت و منفی برای رپید نداریم. می‌خواهیم ببینیم مشکلی در PCR وجود نداشته باشد

– کنترل منفی: همه موارد مورد نیاز به غیر از رشته الگو اضافه می‌کنیم.

– کنترل مثبت: از ژن اصلی که رشته الگو وجود داشته باشد.

  • روش رپید حتی گونه ها را هم می‌تواند از هم جدا کند ولی زیرگونه ها را نمی‌تواند جدا کند و در این گونه موارد می‌توان از ISSR و RFLP و… استفاده کرد.
  • وقتی یک توالی را برای ساخت پرایمر سفارش می‌دهیم قبل از آن می‌پرسند با چه O.D ساخته شود.
  • پرایمر را بصورت خشک (Frizedryer) درخواست کنیم نه مایع. به همراه آن یک فرم اطلاعات می‌دهند که مثلاً چه مقدار آب به آن اضافه کنیم. ابتدا تمام 10 میکرومولار را نریزیم بلکه ابتدا استوک درست کنیم (با مقدار آب کمتر) و در جای مطمئن نگهداری کنیم.
  • اگر PCR به ندرت جواب نداد یکی از اجزای آن که احتمالاً خراب است پرایمر می‌باشد.
  • هنگام اضافه کردن مواد بهتر است موادی که غلظت لازم آنها کمتر است در مراحل آخر اضافه کنیم.
  • در گرفتن آب دوبار تقطیر با سمپلر همیشه یکی دو تا میکرولیتر بیشتر بگیریم تا برای آخرین رشته الگو، آب کم نیاوریم.
آب 57 میکرولیتر (برای سه ویال)
بافر 7.5
MgCl2 2.1
رشته Forward 3
رشته Reverse 3
dNTP 1.5
آنزیم 0.9
رشته الگو (tem) 0.3
حجم کل موارد 75

(مقادیر بالا بر حسب میکرولیتر μl می باشد)

  • MgCl2برای ایجاد شرایط بهینه برای واکنش PCR اضافه می شود.
  • آنزیم سنگین است و هنگام ریختن با سمپلر دقیقاً معلوم است که ریخته می‌شود.
  • رشته الگو همان قطعه مورد نظر (رشته الگو ـ template) است و به علت غلظت کم و سبکی آن هنگام ریختن با سمپلر معلوم نیست که ریخته می‌شود یا نه.
  • در انتها با سمپلر چند بار کل موارد بافر را بالا کشیده و دوباره می‌ریزیم تا خوب مخلوط شود. سپس به مقدار برابر (25تایی) در سه ویال تقسیم می‌کنیم و در دستگاه PCR می‌گذاریم.
  • PCR در سه مرحله انجام می‌شود:
95°C 5min Step 1
95°C 30s Step 2
  55°C 30s
72°C 1min
72°C 7min Step 3
 4°C

 

فرستادن دیدگاه

مشاوره و راهنمايي

اطلاعيه

1. در صورت خريد چندين جزوه بصورت يكجا، مي توانيد به سايت فروشگاهي اگريسافت مراجعه فرماييد:
agrifile.ir

2. سفارش پرينت، طلق و فنر جزوات و ارسال با نازل‌ترين قيمت پذيرفته مي شود.
نحوه سفارش/

فرهنگ واژگان تخصصي

تازه هاي اگريسافت

> فروشگاه كتاب

> ترجمه تخصصی مقالات فارسی به انگلیسی

> مشاوره در زمينه مقالات ISI :
ـ استخراج مقاله از پایان نامه های کارشناسی ارشد و دکتری و طرح های پژوهشی؛
ـ ویرایش علمی مقالات متقاضیان قبل از ارسال به مجلات؛
ـ انتخاب مجلات ISI متناسب با کیفیت مقالات و همچنین زمان متقاضیان؛
ـ تشخیص اعتبار مجلات ISI ؛
ـ اطلاع رسانی در مورد مجلات خارج شده از لیست ISI ؛
ـ ارسال مقالات و پیگیری اخذ اصلاحات داوران؛
ـ انجام اصلاحات داوران و ادیتور مجلات تا زمان اخذ پذیرش نهایی و همچنين آناليز ديتا ؛
ـ اطلاع رسانی به موقع در مورد لیست سیاه وزارت علوم و دانشگاه ها.

فعالسازی فرهنگ واژگان Breedic

برای فعال سازی نرم افزار اینجا کلیک نمایید.

فعالسازي فرهنگ واژگان Biodic

1. نسخه اینترنتی

2. نسخه CD